第二十一章 癌基因和抑癌基因
一、癌基因的概念及分类：
癌基因（oncogene)是指存在于正常细胞内，与细胞生长发育调控有关的一组结构基因。癌基因可按其来源不同而分为病毒癌基因（v-onc）和细胞癌基因（c-onc）。
1．病毒癌基因：
具有致癌性的肿瘤病毒有两种类型：一种是DNA肿瘤病毒，另一种是RNA病毒即逆转录病毒。DNA肿瘤病毒的基因组的早期功能基因编码转化蛋白，如病毒SV40的 A基因编码大T抗原，分布于胞核，可与p53结合而使之失活。RNA病毒基因组中可含有致癌基因，并表达相应的转化蛋白，感染动物后即可诱发肿瘤。
2．细胞癌基因：
细胞癌基因(c-onc)又称为原癌基因(protooncogene)，大多数的原癌基因属于调控细胞生长分化的正常基因，原癌基因的蛋白产物是通过影响细胞生长分化中的控制系统而起作用的。原癌基因激活后可引起细胞生长分化失控，从而导致细胞癌变。目前发现的细胞癌基因已超过100种，根据这些基因表达蛋白产物的功能可将细胞癌基因分为四大类：
⑴生长因子类：如c-sis癌基因，其编码产物为PDGF的β链。
⑵G蛋白类：如ras家族，其编码产物为存在于细胞膜上的G蛋白，能传递生长信号。
⑶受体及信号蛋白类：如src家族，其编码产物为细胞内的生长信号传递蛋白，通常含酪氨酸蛋白激酶活性。
⑷转录因子类：如myc家族和myb家族，其编码产物为存在于细胞核内的转录因子。
二、癌基因的激活机制：
1．插入激活：指来源于病毒等的启动子或增强子插入到细胞癌基因的附近或内部而使其开放转录。
2．基因重排：基因从正常位置转移到另一位置，常常是插入一启动子后而使其转录活性增加。
3．基因扩增：基因数量的增加。
4．突变点：ras癌基因的点突变，导致其GTPase活性下降，从而使其保持激活状态。
三、抑癌基因及其作用机制：
抑癌基因又称为抗癌基因(anti-oncogene)，是指存在于正常细胞中，其编码产物能抑制细胞生长增殖的一组结构基因。常见的抑癌基因有Rb基因，p53基因，p16基因等。其中，Rb基因编码p105Rb转录因子，p53基因编码p53转录因子，p16基因编码一种p16蛋白。
1．Rb基因的作用机制：
Rb基因的失活主要与视网膜母细胞瘤的发生相关。低磷酸化型的p105Rb可与促进细胞分裂的转录因子E2F结合形成复合物，从而阻止E2F对某些与细胞增殖相关的基因启动转录。高磷酸化型的p105Rb则可促使其与E2F转录因子分离，从而使其呈现活性，细胞即由G1期进入S期。
2．p53基因的作用机制：
p53蛋白一般都位于核内，可与特异的DNA片段结合。其酸性区域具有许多转录调节因子的共同特征，并与寡聚体的形成有关。p53蛋白能以四聚体的形式与DNA结合，调节其它基因的表达。p53蛋白的生物学功能有：① 转录调节及抑制细胞生长的作用：p53蛋白促进WAF1/CIP1基因表达产生一种分子量为21kD的蛋白质（p21WAF1/CIP1），诱导细胞生长停滞于G1期。② 参与程序性细胞凋亡：p53 蛋白启动不能修复的损伤细胞进入程序性凋亡。③ 抑制DNA复制：p53蛋白与复制蛋白A(repA)结合后可抑制其与单链DNA的结合，阻止细胞进入S期。
第二十三章 分子生物学常用技术
一、分子杂交与印渍技术的原理：
1．分子杂交：
不同来源的单链核酸（DNA或RNA），只要它们具有大致相同的碱基序列，经过退火处理，就能重新形成杂种双螺旋，这一现象称为分子杂交（molecular hybridization）。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。
2．印渍技术：
印渍技术的原理首先由Edwen Southern在1975年提出。其基本操作过程是：将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳分离后，置NaOH液中浸泡，从而将凝胶中的DNA变性为单链；然后将一张硝酸纤维素膜铺在凝胶上，上面放上大量吸水纸巾，利用吸水纸巾的毛细作用，将单链DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，再将膜置80℃烘干并使单链DNA分子固定在膜上，再用于分子杂交分析。因此，用于DNA印渍的技术又称为Southern Blotting或Southern 杂交。
3．探针技术：
将已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记，然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。
二、印渍技术的类别及应用：
1．DNA印渍技术：又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。
2．RNA印渍技术：又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。
3．蛋白质印渍技术：又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。
三、PCR技术：
1．PCR的概念：PCR(polymerase chain reaction)即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。
2．PCR反应系统的组成：
⑴耐热DNA聚合酶（Taq酶）：这是由耐热水生细菌体内提取的一种DNA聚合酶。
⑵模板DNA：即待分析的目的DNA，其长度不宜大于10kb。
⑶两种引物：为了保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板DNA链的3`-端。
⑷四种脱氧核糖核苷酸：用作底物的dNTPS。
⑸缓冲溶液：保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值。
3．PCR的反应原理：一般采用变性-复性-延伸三步循环，也可采用变性-延伸两步循环。
⑴变性：将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到950C，使双螺旋DNA解开成为单链。
⑵复性：通过降低反应温度至550C，使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3`端粘合。
⑶延伸：将反应温度提高到约700C，在耐热DNA聚合酶的催化下，合成两条互补链，从而使模板DNA扩增一倍。按照上述步骤重复操作约30次，即可将模板DNA扩增数百万倍。
4．PCR的主要用途：
⑴目的基因的克隆：是迅速获得一定量的目的基因的有效方法之一。① 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获得已知的目的基因；② 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的DNA片段；③ 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。
⑵基因的体外突变：采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。
⑶DNA的微量分析：由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA的分析检测。
四、DNA碱基序列测定：
DNA碱基序列测定即DNA一级结构的测定，目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的化学裂解法和Sanger建立的双脱氧末端终止法。双脱氧末端终止法的主要操作步骤有：
1．获得待测DNA片段的单链模板：一般采用基因工程的方法以获取一定数量的单链待测DNA模板。可将待测DNA片段与噬菌体M13DNA进行重组，然后将其导入大肠杆菌进行增殖，M13噬菌体一般以单链DNA形式透出细胞再感染新的细菌，故此可获得单链DNA模板。
2．合成寡核苷酸引物：利用DNA合成仪合成一段与待测DNA片段的3’-端互补的寡核苷酸引物。
3．模板-引物杂交：将待测单链DNA模板与寡核苷酸引物混合，并进行保温处理，使引物与DNA单链模板的3’-端进行杂交。
4．互补链的延长和终止：将上述杂交混合液分为四份，每份混合液中均加入DNA聚合酶，四种dNTPS，一种带放射性同位素标记的脱氧核糖核酸（如α-32P-dATP）。此外还需分别加入一种双脱氧核糖核酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP）。然后在适当温度条件下延伸互补链，就可得到四组分别以A、G、C、T、终止的长短不一的互补链的混合物。
5．电泳分离：将四组含有长短不等的反应混合物在同一聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，即可将只相差一个核苷酸的寡核苷酸链分离开。
6．放射自显影：将电泳凝胶进行放射自显影，即可得到放射自显图谱，通过该图谱即可直接读出核苷酸的排列顺序。
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